如何提高電轉(zhuǎn)效率？

電轉(zhuǎn)，也稱電穿孔法，是通過(guò)脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔，將外源分子（DNA、RNA 、mRNA等）導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)，來(lái)改變細(xì)胞的特性，從而達(dá)到改造細(xì)胞的目的，是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞基因功能和蛋白質(zhì)表達(dá)研究的重要工具。那么該如何提高電轉(zhuǎn)效率呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、細(xì)胞收集時(shí)：

1)在消化貼壁細(xì)胞時(shí)，一定要注意終止胰酶反應(yīng)，防止過(guò)度消化；最好使用專業(yè)的胰酶中和劑；

2)在進(jìn)行細(xì)胞離心時(shí)，使用低轉(zhuǎn)速長(zhǎng)時(shí)間離心，提升細(xì)胞的存活率；

3)選擇合適狀態(tài)的細(xì)胞，一般原代細(xì)胞可以傳1-2次后使用；盡量挑選迭代次數(shù)少的細(xì)胞，如果是凍存細(xì)胞，建議復(fù)蘇1-2h后使用；

4)選擇對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞；

5)做好支原體清除。

二、試劑添加：

1）電轉(zhuǎn)試劑的添加只需室溫操作即可；

2）細(xì)胞在試劑中停留不超20min，混合好盡快開(kāi)始實(shí)驗(yàn)；

3）轉(zhuǎn)染的底物占比不能大于總體積的10%，比如轉(zhuǎn)染體系100ul，底物最多添加10ul；

4）在消化的細(xì)胞進(jìn)行配置時(shí)，一定要離心并完quan去除殘留培養(yǎng)基；

5）在加入到電極杯中時(shí)，要避免產(chǎn)生氣泡，從而影響電脈沖；

6）對(duì)底物進(jìn)行內(nèi)毒素控制；

7）轉(zhuǎn)染試劑與底物濃度配比控制；

8）如果是mRNA轉(zhuǎn)染，可多洗滌2次。

三、程序設(shè)置：

1）使用電轉(zhuǎn)儀，程序已經(jīng)設(shè)定好，可以根據(jù)不同的細(xì)胞名稱，選擇對(duì)應(yīng)的最you程序；根據(jù)實(shí)際情況，可以對(duì)程序進(jìn)行微調(diào)，確保轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。

2）使用需要自行設(shè)置的儀器，一般電場(chǎng)強(qiáng)度設(shè)置遵循低電場(chǎng)、長(zhǎng)時(shí)程的原則。

四、細(xì)胞重懸：

1）轉(zhuǎn)染結(jié)束之后，可以先停留10min再加培養(yǎng)基重懸；

2）使用無(wú)鈣培養(yǎng)基重懸，5-10min后轉(zhuǎn)移細(xì)胞到培養(yǎng)皿上；

3）后續(xù)的實(shí)驗(yàn)一般在轉(zhuǎn)染后24h再進(jìn)行；

4）電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞，鋪板數(shù)量翻一倍。

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