DNA轉(zhuǎn)染有何注意事項(xiàng)？

轉(zhuǎn)染是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，那么你知道DNA轉(zhuǎn)染有何注意事項(xiàng)嗎？讓我們一起來看看吧！

一、質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染注意事項(xiàng)

1. 啟動子的選擇

啟動子的選擇對于轉(zhuǎn)染基因的有效表達(dá)是非常重要的。對于轉(zhuǎn)染過程本身雖然無甚影響，但是對轉(zhuǎn)染結(jié)果卻有著微妙的影響。

2. 質(zhì)粒的大小和質(zhì)量

線性化還是超螺旋會影響轉(zhuǎn)染結(jié)果：超螺旋質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比線性DNA高得多，特別是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。而線性化DNA轉(zhuǎn)染的整合幾率高。質(zhì)粒太大了轉(zhuǎn)染會困難一些。畢竟，相對致密、較小的外源異物被細(xì)胞內(nèi)吞的幾率要大一些。如果你的質(zhì)粒正好比較大，又沒有經(jīng)驗(yàn)，選擇特別注明可以轉(zhuǎn)大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑成功幾率會高一些。有的轉(zhuǎn)染試劑還會提供一些促進(jìn)DNA凝聚的成分，使得DNA形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)更致密一些，更容易轉(zhuǎn)染一些。純化質(zhì)粒的質(zhì)量也會影響轉(zhuǎn)染效率，一定要選擇高質(zhì)量的質(zhì)粒。

3. 質(zhì)粒DNA的濃度和量

既然質(zhì)粒純化已經(jīng)不成問題，初學(xué)者通常都不會在乎甚至愿意多加點(diǎn)DNA，但是要注意的是，DNA量過少固然轉(zhuǎn)染效率不高，DNA量過多同樣會降低轉(zhuǎn)染效率。所以預(yù)實(shí)驗(yàn)需要按照說明書的要求，按一定比例混合適量的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑。有的轉(zhuǎn)染試劑要求DNA的量多些，有的轉(zhuǎn)染試劑效率高只要很少DNA。

4. 轉(zhuǎn)染試劑的選擇

在確定了質(zhì)粒的質(zhì)量之后，就要考慮轉(zhuǎn)染試劑的選擇了。目前大多數(shù)用的是脂質(zhì)體類的轉(zhuǎn)染試劑，但這類試劑的毒性較大，轉(zhuǎn)染效率低，最好選擇非脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑，如Entranster試劑。

二、細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)染注意事項(xiàng)

1. 優(yōu)化條件

質(zhì)粒不同，所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不同及定量的準(zhǔn)確性等因素會導(dǎo)致在一些情況下所做的轉(zhuǎn)染不在該優(yōu)化條件內(nèi)。這種情況下需要對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑的配比進(jìn)行優(yōu)化。另外，可選用更合適的轉(zhuǎn)染試劑，如Entranster試劑。

2. 抑制劑

不要在用于制備DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物的培養(yǎng)基中使用抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。

3. 細(xì)胞狀態(tài)及融合度

長勢旺盛的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果更佳，細(xì)胞密度應(yīng)該在轉(zhuǎn)染時(shí)融合度至少70%以上。

4. DNA純度及數(shù)量

確保質(zhì)粒OD值A260/A280在1.8~2.0之間。DNA量不能太高，單獨(dú)DNA也會對細(xì)胞生長有一個(gè)基礎(chǔ)的影響。

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