巨噬細胞的提取和分離方法是什么？

巨噬細胞是機體免疫系統的重要細胞成分，具有抗感染、抗腫瘤和參與免疫應答、免疫調節等生物學功能。腹腔巨噬細胞多游離存在于腹水中易于獲得。因此，可以通過向小鼠腹腔內注射刺激物制造無菌炎癥環境以積聚巨噬細胞，來進行巨噬細胞研究。那么巨噬細胞的提取和分離方法是什么呢？讓我們一起來看看吧！

一、材料

小鼠，SPF級，體質量18～22 g，雄性，6～8周齡。

二、肉湯制備

1. 6%淀粉肉湯制備

將1.0g胰蛋白胨、0.3g牛肉浸膏和0.5g氯化鈉放入盛有100 mL雙蒸水的燒杯中，置于磁力攪拌器常溫溶解后121℃滅菌30min，于4℃保存。

2. 3%巰基乙酸鹽肉湯的制備

1L雙蒸水中加入29g巰基乙酸鹽，煮沸使其wan全溶解，玻璃瓶或離心管分裝后121℃滅菌15min，4℃保存，使用前確保已經冷卻。

三、巨噬細胞的誘導

每次腹腔注射3%巰基乙酸鹽肉湯1mL，每天1次，3d后用預冷PBS灌洗腹腔2次。

四、巨噬細胞的收集

準備75%乙醇，以脫頸方式處死小鼠，浸泡3min。取出，置于無菌操作臺，仰臥位固定小鼠，右手持注射器于右下腹部將針頭刺入皮下進入腹腔，將5mL預冷的PBS(培養液組為5mL預冷的10%血清RPMI 1640培養液) 注入腹腔，按摩小鼠腹部5min。無菌條件下剪開小鼠腹部皮膚顯露胸腹部，用無菌止血鉗提起劍突處組織，無菌剪刀在該處剪開約1mm2小口。注意止血鉗保持提起狀態，用無菌巴氏吸管從腹腔開口深入腹腔，反復沖洗腹膜腔灌洗液2次，可回收約8mL 淡黃色灌洗液。

五、巨噬細胞的純化與培養

將每只小鼠的灌洗液于常溫條件下1000r /min 離心10min，所得細胞沉淀用ＲPMI 1640培養液重懸接種，培養體系于37℃靜置培養2～3h后洗去未貼壁細胞，余下的貼壁細胞即為巨噬細胞

六、巨噬細胞形態學觀察及計數

細胞貼壁培養24h后在倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態。用0.5%胰酶消化細胞，離心棄上清液，PBS重懸得到細胞懸液，用細胞計數板計數每只小鼠腹腔中分離的巨噬細胞數量。

七、臺盼藍染色檢測巨噬細胞活性

將500μL的各組巨噬細胞懸液和500μL臺盼藍染液(0.4%濃度) 加入3.5cm培養皿，搖勻后靜置3～8min; 吸取1滴混合液滴入載玻片，3min內鏡下計數巨噬細胞200個，分別統計活/死細胞數目(死細胞呈藍色，活細胞無色透亮) ; 細胞活性(%) = 活細胞數/200×100%。每組檢測重復3次。

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