蛋白表達(dá)的常見問題有哪些？

蛋白表達(dá)實驗的時，有時候?qū)嶒灂X得參考實驗方法和克隆的蛋白基因序列wan全沒有問題，但蛋白電泳就是沒有結(jié)果。下面讓我們一起來看看蛋白表達(dá)的常見問題有哪些吧！

1、載體構(gòu)建錯誤，很多克隆新人經(jīng)常弄錯讀碼框。比如Qiagen的pQE系列載體，其克隆位點常有一兩個堿基的區(qū)別；另外有些酶產(chǎn)生粘端有些酶產(chǎn)生平端，這些都容易導(dǎo)致讀碼框錯誤，從而表達(dá)不出來。

2、宿主菌選擇不當(dāng)，不同的宿主菌其基因型是不一樣的。有些經(jīng)過特殊修飾的載體，或者特殊用途的載體，或者有特殊啟動子的載體，必須選擇合適的宿主菌進行表達(dá)。因此，當(dāng)你的蛋白沒有表達(dá)出來時，可以考慮更換宿主菌。

3、密碼子的使用頻率低。有些基因其本身含有許多稀有密碼子，尤其是起始密碼之后的15個堿基之內(nèi)的稀有密碼子，對蛋白表達(dá)有著很重要的影響。優(yōu)化密碼子對原核表達(dá)似乎效果很好，對真核表達(dá)系統(tǒng)未見得有很好的效果。

4、質(zhì)粒不穩(wěn)定或者質(zhì)粒丟失。pET系統(tǒng)通常比較穩(wěn)定。但是你選用帶氨芐青霉素抗性的載體時，也許有可能產(chǎn)生β-lactamase降解了抗生素，使質(zhì)粒丟失。還有一種情況是表達(dá)重組的毒素蛋白，對宿主細(xì)胞也有毒性，造成質(zhì)粒丟失。這種情況多見于真核表達(dá)系統(tǒng)。

5、蛋白酶將蛋白降解了。這種情況常由重組蛋白本身的N-或C-端序列引起的。當(dāng)?shù)鞍?/span>N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr這些氨基酸時，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端規(guī)則。N-端是Met時，大腸桿菌可以悄悄地把這個Met偷走，特別是Met后緊跟著一個帶小側(cè)鏈的氨基酸時。C-末端存在非極性氨基酸時，也容易導(dǎo)致蛋白被降解。C末端最后5個氨基酸是極性的或者帶電荷的，則不易被降解。

6、二級翻譯起始位點。這種情況見于你的序列里正好含有和核糖體結(jié)合位點wan全一致的序列。那就怪不得人家了，核糖體會很高興地找到這個位點，然后開始翻譯，致使你的蛋白被截短，在電泳時看不到預(yù)期大小的片段。

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