PCR到底是什么？

PCR技術(shù)問(wèn)世已有30多年，期間創(chuàng)新性生物技術(shù)不斷涌現(xiàn)，然而PCR技術(shù)的地位依然不可撼動(dòng)，PCR的全稱是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction），簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，PCR技術(shù)是利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，在生物體外大量擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)，PCR作為一項(xiàng)bi不可少的技術(shù)手段，仍被廣泛應(yīng)用在基因克隆、基因表達(dá)分析、病原體檢測(cè)、疾病診斷、基因測(cè)序、生物制藥、基因/細(xì)胞治療、分子育種、物種鑒定、法醫(yī)鑒定等各個(gè)領(lǐng)域。

標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程包括三個(gè)步驟：變性(Denaturation)——退火(Annealing)——延伸(Extension)。

一、變性

變性是通過(guò)高溫（通常為90～95℃）破壞雙鏈DNA的氫鍵，使其變成單鏈DNA。變性的時(shí)間和溫度會(huì)根據(jù)DNA片段的復(fù)雜程度、GC含量、大小以及緩沖液的鹽濃度來(lái)確定。

二、退火

退火是指在DNA形成單鏈之后，通過(guò)降低溫度，使引物能夠結(jié)合到單鏈DNA的目標(biāo)區(qū)域上。一般情況下，引物完成退火所需的孵育時(shí)間為0.5-2分鐘。通過(guò)計(jì)算PCR擴(kuò)增引物的熔解溫度（Tm），可以確定適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟龋ǔ１纫锏?/span>Tm低3-5℃。

三、延伸

指DNA模板--引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，目標(biāo)序列為模板，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的鏈。

在延伸階段，DNA模板與引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，在模板的指導(dǎo)下，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)和半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的鏈。一般將溫度設(shè)定在70-75℃之間，因?yàn)闊岱€(wěn)定性DNA聚合酶在這個(gè)溫度下活性最佳。延伸的時(shí)間取決于DNA聚合酶的合成速度和目標(biāo)DNA的長(zhǎng)度。當(dāng)目標(biāo)片段的擴(kuò)增長(zhǎng)度較長(zhǎng)（如大于10 kb）時(shí)，除了需要增加延伸時(shí)間，還需降低溫度，以確保引物能在長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)中保持酶的活性。另外，假如引物退火溫度與延伸溫度相差未超過(guò)3℃，則退火和延伸溫度可合并成一步，稱為兩步PCR法，可取代傳統(tǒng)的三步PCR法。兩步PCR法無(wú)需在退火和延伸之間轉(zhuǎn)換和穩(wěn)定溫度，從而縮短了PCR所需的時(shí)間。通過(guò)重復(fù)變性——退火——延伸這三個(gè)過(guò)程，即可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈"，而這種新鏈又能作為下個(gè)循環(huán)的模板，不斷循環(huán)。

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