細菌內毒素的檢測方法

我們知道環(huán)境中廣泛存在的格蘭氏陰性菌容易污染生產過程，其裂解后會釋放出內毒素，因內毒素耐熱性和化學穩(wěn)定性強而難以滅活，所以一旦有內毒素污染進入血液，即使極少量也能引起發(fā)熱休克等嚴重反應，因而內毒素與其他已知熱原污染物相比，顯示更強的熱原性。

而熱原檢測不同于無菌檢測，兩者應同時進行。無菌檢測通常檢測微生物產生的活生物體或孢子，但無法檢測內毒素，只能進行熱原檢測。下面我們來簡單了解有哪些檢測細菌內毒素的不同方法有家兔熱原檢查法、凝膠法(鱟試劑)、光度測定法(鱟試劑)、重組C因子法等

一、家兔熱原檢查法

20世紀40年代，第12版美國藥典中納入了第一個基于兔子模型的熱原實驗。兔子熱原測試是將樣本注射到多只兔子體內，致熱物質的存在導致兔子在注射3-6 h后發(fā)熱。兔子熱原試驗(RPT)的基礎是測量兔子在靜脈內注射待測樣品的無菌溶液后溫度的升高。如果樣品中含有熱原，兔子的體溫會升高0.6℃。

優(yōu)點: 可以檢測所有類型的熱原物質；

缺點: 動物個體差異大導致檢測靈敏度低；對于毒性大的藥物如放射性藥物或腫瘤抑制劑等，無法進行檢測；定性而非定量方法，不能用于藥品生產過程中的質量控制。

二、 鱟試劑檢查法

20世紀70年代，分為凝膠法、濁度法和顯色基質法。這是一種使用鱟變形細胞裂解物測定內毒素的體外方法。主要試劑鱟變形細胞裂解物(LAL)是從鱟(Limulus polyphemus)中提取的血細胞(變形細胞)的水提取物。鱟試劑法的反應機理是細菌內毒素在二價陽離子參與下激活鱟血細胞溶解物中的一系列凝聚酶的反應。

優(yōu)點: 易操作，靈敏度高，可用于內毒素定量檢測；

缺點: 鱟血批次間有差異；對革蘭氏陰性菌以外的內毒素不靈敏；易受β-葡聚糖(β-Glucans)影響而產生假陽性；鱟受到動物保護，無法大批量供應。

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三、 重組C因子法

21世紀初，通過重組方法產生C因子。因子C是由內毒素結合激活的級聯(lián)反應的第一個成分，C因子激活B因子。另一種替代途徑是G因子被葡聚糖結合激活。C因子和G因子都將促凝血酶轉變?yōu)槟浮?/span>C因子可以選擇性地識別內毒素并觸發(fā)蛋白酶級聯(lián)反應。因子C已被純化和克隆以創(chuàng)建內毒素特異性測定。

優(yōu)點: C因子來源穩(wěn)定，受批次影響小；操作簡單快速；更強的抗干擾能力(不受β-glucans影響)；專屬性好。

缺點: 來源于不同品種鱟血蛋白序列的重組蛋白對內毒素的反應性可能不同。

rFC檢測的原理是內毒素結合會激活重組C因子。這種活性結合會裂解合成底物，從而產生熒光化合物，該測定在96孔板上進行。使用380/440nm的激發(fā)波長，在零時和37℃±1℃下孵育一小時后，在微孔板讀數中測量熒光。對數凈熒光(1 h和時間零讀數之間的差異=ΔRFU)與對數內毒素濃度成正比，并且在0.005-5.0EU/ml范圍內呈線性關系。

四、 單核細胞活化試驗

單核細胞激活試驗(MAT)有助于檢測和量化激活人類單核細胞以釋放負責發(fā)燒反應的介質的物質。該測試探索人類發(fā)燒反應，提供比RPT更好的熱源活動信息。該測試不僅可以確定內毒素熱原，還可以幫助確定非內毒素熱原。

MAT測試可檢測細胞因子、前列腺素(IL-1/IL-3)和由單核細胞激活的致熱物質產生的腫瘤壞死因子α(TNF-α)。然后使用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)檢測這些白細胞介素。

MAT的一般原理為熱原+人類白細胞→白細胞介素 →使用ELISA檢測并以IU/ml進行定量。MAT的一般程序包括三個基本步驟: 激活單核細胞，孵育產生IL-6，并使用軟件進行定量分析。

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