慢病毒轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞全流程詳解

慢病毒轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞全流程詳解

一、細(xì)胞種板

將細(xì)胞種在12孔板中，每孔1.5×10^5個(gè)細(xì)胞。每孔加入1ml wan全培養(yǎng)基。
二、病毒感染

1. 待細(xì)胞生長(zhǎng)至30%～50%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。
2. 將病毒從冰箱取出，放在冰上融化。
3. 打開生物安全柜，關(guān)閉風(fēng)機(jī)，戴好帽子和口罩。
4. 棄去培養(yǎng)基，用PBS洗三次。
5. 每孔加入500ul wan全培養(yǎng)基。
6. 根據(jù)公式計(jì)算每孔所需病毒量：每孔病毒量（μL）= MOI x 細(xì)胞數(shù) / 病毒滴度（TU/mL）× 1000。

7. 4小時(shí)后，再向孔板中加入500ul wan全培養(yǎng)基，補(bǔ)足1ml。

三、換液

 感染后24小時(shí)，吸去含病毒的培養(yǎng)液，換上新鮮的 wan全培養(yǎng)液，繼續(xù)37℃培養(yǎng)。

四、觀察與篩選

感染后48小時(shí)，通過熒光顯微鏡初步觀察GFP表達(dá)效率。一般感染后72小時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰。
對(duì)于攜帶Puromycin抗性基因的病毒，換上含適當(dāng)濃度Puromycin的新鮮 wan全培養(yǎng)液，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞株。

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