DNA 結(jié)合蛋白的凝膠阻滯分析實驗

材料與儀器

作為對照的核提取物或蛋白組分 核提取物或蛋白組分
Ficoll 400 聚乙烯醇 蔗糖染色液 10X Tris-氨基乙酸或Tris-硼酸-EDTA(TBE)緩沖液 4%~7% 中性聚丙烯酰胺凝膠 poly(dI-dC) 32P標(biāo)記的對照DNA 32P標(biāo)記的靶DNA
雜交膜

步驟

材料
緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的組成請參見附錄1。
貯存液需稀釋到適當(dāng)濃度。
Ficoll 400(20%m/V)
Ficoll溶解在無菌水中，分裝成100ul并凍存在-20°C。
聚乙烯醇（10%m/V)
聚乙烯醇溶解在無菌水中, 分裝成100ul并凍存在-20°C。
蔗糖染色液
0.25%(m/V)溴酚蘭
0.25%(m/V)二甲苯青
40%(m/V)蔗耱（葡萄糖）
溶解于水，用0.22um濾器過濾；貯存于室溫或4°C。
10X Tris-氨基乙酸或Tris-硼酸-EDTA(TBE)緩沖液
凝膠
4%~7% 中性聚丙烯酰胺凝膠（厚度≤1.5 mm)
核酸和寡核苷酸
poly(dI-dC)(lmg/ml)
適量poly(dI-dC)溶于無菌水中，每管分裝100ul并凍存在-20°C。關(guān)于poly(dI-dC)在凝膠阻滯試驗中的作用的更多信息請見信患欄poly(dI-dC)部分。

放射性化合物
32P標(biāo)記的對照DNA
32P標(biāo)記的靶DNA>20bp[比活性≥2.5x107cpm/噸（≥5000cpm/fmol)]
DNA 片段標(biāo)記可以通過磷酸化（第 9 章方案 13~16, 或第 10 章方案 2); 用 DNA 聚合酶補(bǔ)平 3'-退縮末端（第 9 章方案 10, 或第 10 章方案 7); 或用 PCK 方法使帶放射標(biāo)記的核苷酸播到探針中（第 8 章方案 1)。最后一種方法最快，提供的探針比活性也最高有關(guān)怎樣標(biāo)記 DNA 探針的建議，請見本方案末尾的欄目：疑難解析及凝膠阻滯分析試驗的優(yōu)化。
特殊設(shè)備
雜交膜
細(xì)胞和組織
作為對照的核提取物或蛋白組分
核提取物或蛋白組分
用方案 1 中介紹的任意一種方法制備提取物。在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物或麥胚提取物中進(jìn)行體外翻譯得到的蛋白也可以用來作為 DNA 結(jié)合蛋白。如果是后一種情況，通常用 1~20ul 蛋白來替代核提取物。
方法
1. 在無菌的 1.5 ml 離心管中加入:
32P 標(biāo)記的靶 DNA 1ng(1~10fmol)
1 mg/ml poly(dI-dC) 1ul
核提取物（5~10ug） ≤10ul
或者
蛋白組分 ≤10ul
20%Ficoll 400 5ul
或者
10% 聚乙烯醇 4ul
H2O 加到 20ul
2. 反應(yīng)管離心幾秒鐘使反應(yīng)混合物沉到管底。冰浴 10~30 min。

3. 每管加入 3ul 蔗糖染色液。樣品加到 4%~7% 中性聚丙稀酰胺凝膠中。

4. 在 0.5XTris-甘氨酸緩沖液或 0.5XTBE 緩沖液中跑膠，200~250V,20mA,≥2 h。
根據(jù)結(jié)合蛋白的不穩(wěn)定性和結(jié)合反應(yīng)的親和性，有時候可能需要在 4°C 跑膠。

5. 電泳完成后，撬開凝膠板，把凝膠轉(zhuǎn)到一片結(jié)實的雜交膜上，在干膠機(jī)上干膠約 1 h。

6. 用干膠對 X 射線膠片在-20°C 曝光≥1h, 使放射標(biāo)記的 DNA 片段顯現(xiàn)出來。豐度低一些的 DNA-蛋白復(fù)合物用磷屏圖像分析大約 1~3 h 就可以檢測到。