影響免疫組化（IHC）實驗結果的因素有哪些？

免疫組化技術是利用已知的特異性抗體或抗原能特異性結合的特點，通過化學反應使標記于結合后的特異性抗體上的顯示劑通過借助顯微鏡的觀察，從而在抗原抗體結合部位確定組織細胞結構的一門組化技術。那么影響免疫組化實驗結果的因素有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、組織的固定

組織固定的好壞直接影響免疫組化的結果，選擇良好的固定液并及時充分的固定可以防止組織自溶，最大限度保留組織的抗原性，保證免疫組化結果的準確性。

常用固定液：

10%的中性緩沖福爾馬林（40%甲醛10ml+0.01mol/LPBS90ml(pH7.4)），一般固定液的量為組織塊體積的4~10倍，固定時間（常溫條件下固定8~24h）。

二、組織的脫水

組織脫水不che底，會出現組織掉片的現象，而且顯色效果差，容易混淆診斷。

為保證組織脫水che底，應制定相應的更換試劑的制度，及時更換并有專人負責，做好相應的記錄。

三、切片

玻片選擇粘附載玻片，切片不宜厚，推薦厚度3~5μm，可以保證后續修復時最大限度暴露抗原。切片無皺褶、無氣泡，烤片溫度設置65~68℃，時間為3小時。烤片不充分會導致組織脫片影響后續的檢測，但烤片也不宜過度，溫度過高會加速抗原氧化，導致抗原丟失。

四、阻斷內源酶

進行免疫組化標記的組織，通常含有一定量的內源性酶，由于在免疫組化染色過程中，大部分抗體是用過氧化物酶來標記的。

比如我們通常使用HRP即辣根過氧化物酶標記的二抗，酶起催化作用，促進底物的結合，而組織中的內源性酶同樣也能催化底物，這就影響了免疫組化的特異性。所以在加酶標二抗之前，應先用*阻斷內源酶，將對后續檢測結果的影響降到zui低。

五、抗體的選擇和使用

選用與使用的一抗同源性的二抗。要選擇適宜的一抗，不同的二抗與一抗濃度不匹配，都不能得到滿意的結果。

在滴加一抗、二抗時要先輕輕傾去PBS液，選用韌性好、吸水性強的紙巾吸干組織周圍液體，輕壓組織面吸干組織表面水分(不能滑動)，防止試劑被稀釋或致濃度不均，立即滴加適量試劑，用細玻棒將試劑擴展至組織外1～2mm，防止出現邊緣效應，不能觸碰組織，液面厚約1mm為宜。

一抗孵育溫度一般設置37℃1小時或者4℃冰箱孵育過夜，二抗室溫孵育30-60min。為保證實驗結果的可靠性，推薦在實驗中設置同片的陽性對照和陰性對照。

試劑表面的氣泡用玻棒點破，否則氣泡張力作用會導致局部無試劑，出現氣泡下假陰性反應。

六、顯色反應

DAB顯色劑須現配現用，切片多時應分次配制，分批顯色。根據溫度和整體顯色情況決定終止反應，一般顯色時間3～5min，時間過長致顯色過深和背景著色，過短致反應不足或出現假陰性。

由于DAB有一定的毒性，在操作時要特別注意自身的防護，實驗器材專用，以防污染。

七、試劑的保存

因為抗體是蛋白質，保存或使用不當不但會造成浪費，而且變質會出現假陰性結果。

要注意抗體的有效期，對于一次用不完的抗體可保存在冰箱內，而不要放在冷凍室，反復凍融，抗體效價會急劇下降而失效。

同時防止抗體的相互交叉污染和細菌污染。

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